Nascido em 1514 em Haddington, próximo a Edimburgo, na Escócia. Quando jovem recebeu educação em st. Andrews nos moldes da igreja escocesa; depois fez estudos universitários em Glasgow. Em 1536 foi ordenado padre. No final de 1545 professou publicamente sua fé protestante.
Nesta época confrontos entre católicos e protestantes levaram o governo a pedir apoio da França. Em 1547 Knox foi capturado pelos franceses e condenado á prisão. Uma vez liberado, foi para a Inglaterra, onde se tornou capelão do Rei Eduardo VI.
Mas com a ascensão de Maria Tudor foi obrigado a se refugiar na Suíça. Lá conheceu Calvino, se tornaram amigos, até que questões teológicas fizeram com que partisse para Genebra com os da ala radical do calvinismo. Em 1555, Knox voltou para a Escócia, onde pregou com determinação um calvinismo bem rigoroso. Foi considerado como um profeta do Antigo Testamento.
Lendo as Escrituras, convenceu-se de que a ascensão de uma mulher ao poder ia contra a ordem divina. Em 1558, num panfleto, protestou contra o “monstruoso governo das mulheres”. Certamente visava Maria Tudor e a escocesa Maria Stuart, e Elisabeth da Inglaterra. Isso não impediu que inúmeras passagens ácidas provocassem a cólera de uma mulher no poder. Elisabeth não o perdoou jamais.
O reformador escocês escreveu um tratado teológico sobre a predestinação, uma liturgia, uma História da Reforma na Escócia e uma obra na qual desenvolveu a idéia de que as autoridades subalternas tinham o direito e o dever de resistir a um tirano que procurasse impor a idolatria a seus súditos. Participou ainda da elaboração da confissão de fé e do primeiro livro de Disciplina da Igreja escocesa.
John Knox morreu em 1572 na Escócia.